孤儿G蛋白偶联受体（GPCR）的结构测定因缺乏已知配体及其纯化过程中的固有不稳定性而受到阻碍。传统的热稳定性筛选需要配体或纯化蛋白，这限制了其在孤儿GPCR研究中的应用。
2026年5月5日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)汪胜研究组和丛尧研究组联合中山大学李典范教授及国科大杭高院生命学院樊鲁玉博士合作在PNAS 在线发表题为Decoding the structure of GPR151 via NELiS的研究论文。该研究提出了Nb6辅助无配体稳定化平台（NELiS）—一种不依赖配体及纯化的鉴定稳定化突变的方法。
将NELiS应用于GPR151（一种富集于缰核且与神经精神疾病相关的孤儿GPCR），作者鉴定出四个显著提高热稳定性和表达水平的突变，从而实现了受体的纯化。利用稳定化并纯化的受体，作者进一步发现了一种高亲和力、GPR151特异性纳米抗体，该抗体有助于结构测定。
结构分析揭示了经典基序中非典型的抗激活特征，以及占据正构结合袋的自抑制性N端区域。功能研究证实了一种独特的激活机制，并揭示了N端在受体成熟和运输中的关键作用。这些结果确立了NELiS作为孤儿GPCR结构与功能研究的通用工具。
G蛋白偶联受体（GPCRs）包含超过800种七次跨膜（7TM）蛋白，构成了人类细胞表面受体中最大的家族。它们调控多种生理和病理过程，并且是最成功的药物靶点类别，约34%的美国食品药品监督管理局批准的治疗药物通过GPCRs发挥作用。
尽管如此，仍有超过140种GPCRs被归类为孤儿受体，缺乏已识别的内源性配体。许多孤儿GPCRs在中枢神经系统（CNS）中高表达，并且越来越多地被证实与主要的神经精神及神经退行性疾病相关，包括焦虑症、抑郁症、精神分裂症、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病及物质使用障碍。然而，它们的激活机制和生理功能在很大程度上仍不明确。
GPCRs的结构表征对于阐明其激活机制及促进合理药物设计至关重要。尽管已有超过200种GPCRs的结构被解析，但大多数依赖于已知配体（激动剂、拮抗剂或变构调节剂）或细胞内信号转导伙伴（例如，G蛋白或β-抑制蛋白）对受体的稳定作用。
这种依赖性对孤儿GPCRs构成了主要障碍，因为它们通常既缺乏配体，也缺乏明确的G蛋白偶联特征。因此，尽管结构生物学取得了进展，但由于孤儿GPCRs在纯化及用于结晶或冷冻电镜的样品制备过程中固有的不稳定性，约73%的孤儿GPCRs的结构仍未被解析。
图1.NELiS的示意图（摘自PNAS）
纳米抗体——源自骆驼科动物的单域抗体片段—已成为将GPCRs稳定在特定构象状态的强大工具。其中，Nb6因其独特的结合模式而尤为引人注目：其互补决定区3（CDR3）环插入κ-阿片受体（KOR）的跨膜螺旋5（TM5）和跨膜螺旋6（TM6）之间的缝隙，这不同于大多数结合细胞质核心的胞内纳米抗体。
这种相互作用即使在缺乏配体的情况下也能稳定非活性构象，为应用于通常仅以无配体（apo）状态存在的孤儿GPCRs提供了一种有吸引力的策略。耐热稳定点突变对于增强受体稳定性也至关重要；然而，识别此类突变的传统方法需要纯化蛋白或配体结合状态——这些条件对于孤儿GPCRs而言通常难以实现。
为了克服这些根本性障碍，作者开发了Nb6介导的无配体稳定化平台（NELiS），这是一个不依赖配体和纯化的平台，它利用Nb6独特的稳定能力直接在粗裂解物中鉴定耐热稳定突变。
NELiS被应用于GPR151—一种在中枢神经系统富集、且在遗传上与抑郁症和成瘾相关的孤儿GPCR—鉴定出四种能显著增强受体稳定性并实现纯化的耐热稳定突变。这使作者能够分离出一种高亲和力的合成纳米抗体（SB3），并解析了首个GPR151的冷冻电镜结构。
该结构揭示了稳定GPR151非活性状态的独特特征，以及一个占据正构位点的自抑制性N端结构域。功能研究进一步证明了该N端片段在受体成熟、运输和亚细胞定位中的作用。总之，该研究结果阐明了GPR151调控的结构和机制基础，并突显了NELiS作为孤儿GPCRs结构与功能表征的广泛适用性策略的价值。
参考消息：https://doi.org/10.1073/pnas.2534234123