CRISPR screen通过对基因进行定向扰动，并直接观察细胞表型的变化，为研究基因功能与表型之间的因果关系提供了重要手段。随着单细胞测序技术的发展，Perturb-seq、CROP-seq等方法将单细胞转录组测序与CRISPR screen相结合，使研究人员能够在一次实验中获取更加丰富和精细的组学信息。
近年来，空间组学技术的快速发展进一步推动了研究范式的转变，使科学家不仅能够关注细胞内部的基因表达变化，还能够解析细胞与细胞、细胞与微环境之间的空间关系。在这样的背景下，如何将高通量空间转录组测序与CRISPR screen结合，从而在组织原位解析功能基因组学问题，正逐渐成为该领域的重要研究方向。
2026年5月26日，北京大学定量生物学中心曾泽贤团队联合清华大学基础医学院潘登团队及华大生命科学研究院冯驭团队，在Cell发表题为《Uncovering Spatially Resolved Functional Genomics with CRISPR Screen Sequencing》的研究论文。
该研究开发了全新的空间CRISPR筛选技术SPAC-seq（Spatial CRISPR Screen Sequencing）以及空间扰动分析工具包TARDIS。SPAC-seq首次在商业化单细胞分辨率空间转录组平台上实现了高通量CRISPR screen基因功能筛选；TARDIS则是首个面向高维度、高内涵空间扰动组学数据的统计分析工具箱。
两者结合，使研究人员不仅能够观察基因扰动后“发生了什么变化”，还能够进一步解析这些变化“发生在组织中的什么位置”，从而将功能基因组学研究推进到空间维度。
在技术层面，传统空间转录组测序主要捕获带有polyA尾的mRNA，而CRISPR screen中的sgRNA本身并不带polyA尾，加之空间转录组对单个细胞转录本的捕获量有限、存在较高丢失率，因此很难在组织切片中稳定检测到sgRNA信号。
为了解决这一问题，研究团队设计了全新的CRISPR screen载体系统SPACseq，将sgRNA序列嵌入到由小鼠病毒转座子元件驱动的高表达mRNA转录本中，从而使sgRNA能够随着mRNA一起被空间转录组芯片捕获和测序。同时，团队进一步利用逆转录病毒（retrovirus）系统，提高了小鼠细胞系及多种原代细胞的文库转导效率。
相比此前常用的CROPseq体系，SPACseq将小鼠原代细胞的感染效率提高了38倍，并将sgRNA-mRNA嵌合转录本的检出量提高了9倍；相比Perturb-seq中的barcode设计，SPACseq还避免了sgRNA与barcode之间因重组导致的错配问题。
SPAC-seq技术目前已适配两种主流商业化单细胞分辨率空间转录组平台：10x Genomics的Visium HD平台以及华大基因的Stereo-seq平台。在一项包含1,520个sgRNA的大规模筛选实验中，SPAC-seq能够在单张肿瘤切片上稳定检测到超过1,100种sgRNA。
相关实验数据也已在SPAC-seq网站公开：https://spac.pku-genomics.org。值得注意的是，SPAC-seq还进一步设计了sgRNA靶向捕获探针，使sgRNA检测不再完全依赖mRNA嵌入策略，理论上可以兼容任意sgRNA质粒体系，这一方案被称为Direct-capture SPAC-seq。
在这项工作中，研究团队通过三个不同的研究场景展示了SPAC-seq的应用潜力：
（1）第一个应用场景聚焦于“肿瘤转移过程中免疫逃逸微环境的形成”，即功能基因如何塑造肿瘤周围的免疫微环境。研究团队希望回答一个关键问题：究竟哪些基因、细胞组成和信号通路，会帮助肿瘤在转移过程中逃避免疫系统的攻击？
为此，研究人员利用SPAC-seq建立了体内肿瘤转移的空间转录组筛选体系。携带不同基因敲除的肿瘤细胞被注入免疫健全的小鼠体内，并在肺部形成多个转移灶。通过空间转录组分析，研究团队发现这些转移灶可以分为两类：一类富含免疫细胞浸润，另一类则表现为明显的免疫排斥状态。
进一步分析发现，ICAM1基因被敲除后，肿瘤转移灶更容易形成在免疫排斥区域。在分子机制层面，研究人员发现，ICAM1等关键免疫互作基因受到扰动后，肿瘤微环境中的干扰素（IFN）相关信号明显下降；同时，肿瘤细胞与T细胞之间原本重要的ICAM1-LFA-1相互作用也被破坏。
在细胞组成方面，ICAM1缺失会导致T细胞浸润减少，而巨噬细胞比例升高，并进一步向具有免疫抑制作用的M2型巨噬细胞极化。这些巨噬细胞高表达Spp1、Cd163等免疫抑制相关分子，形成更加有利于肿瘤生长和免疫逃逸的微环境。这些结果表明，ICAM1的缺失能够系统性地重塑肿瘤微环境，帮助肿瘤逃避免疫攻击。这一发现不仅验证了SPAC-seq的筛选效能，也为理解肿瘤转移早期的免疫逃逸机制提供了新视角。
（2）第二个应用场景聚焦于“T细胞浸润肿瘤的时空筛选”，即功能基因如何影响T细胞在肿瘤微环境中的空间定位与免疫功能。传统体内CRISPR screen虽然能够筛选调控T细胞抗肿瘤能力的关键基因，但通常难以进一步解析这些基因如何影响T细胞与肿瘤微环境之间的动态互作。
在这项研究中，研究团队首次对小鼠原代CD8⁺ T细胞开展了体内时空CRISPR筛选，系统刻画了T细胞进入肿瘤后的动态演化过程，并追踪不同基因扰动如何改变T细胞在肿瘤中的空间分布以及其所处的微环境状态。结合TARDIS的全局定位和局部富集分析，研究人员发现，CD44 扰动后的T细胞，相比对照组，更容易富集在干扰素（IFN）信号活跃的肿瘤区域。
为了进一步解释这一现象，研究团队结合空间配体-受体分析与细胞互作分析，提出 SPP1-CD44 signaling axis 可能是巨噬细胞抑制T细胞功能的重要机制。其中，巨噬细胞分泌的SPP1通过与T细胞表面的CD44结合，对T细胞产生免疫抑制作用。过去，CD44长期被视为T细胞激活和记忆状态的重要标志物，但其具体功能并不清楚。研究团队通过体内外实验发现，Cd44敲除并不会削弱T细胞功能，反而能够增强T细胞对肿瘤的浸润能力，并维持更持久的抗肿瘤效应。
与此同时，巨噬细胞来源的Spp1则会抑制T细胞活性，包括降低T细胞分泌IFN-γ的能力，并提高线粒体ROS水平，从而削弱其抗肿瘤功能。而这些抑制效应，在T细胞Cd44被敲除后能够明显缓解。更重要的是，研究团队进一步在小鼠模型中验证，无论是使用抗SPP1抗体治疗，还是对巨噬细胞进行Spp1条件性敲除，都能够增强抗肿瘤免疫反应。这提示SPP1-CD44轴有望成为未来肿瘤免疫治疗中的潜在联合干预靶点。
（3）第三个应用场景聚焦于“环境因子与细胞内在因子如何共同调控细胞空间定位”。研究团队结合大规模公共数据的分析，系统研究了影响T细胞在肿瘤中空间分布的关键机制。研究发现，趋化信号轴 CXCR4-CXCL12 signaling axis 与转录因子 BHLHE40 之间存在相互拮抗关系，并共同决定T细胞在肿瘤中的定位与功能。具体而言，Bhlhe40被扰动后，T细胞虽然表现出更低的耗竭状态，但却更难进入肿瘤实质区域，而是更多停留在肿瘤边缘。
进一步分析发现，这是因为Bhlhe40缺失后，T细胞中Cxcr4表达上升，使其更容易受到CXCL12信号的吸引，富集在CXCR4-CXCL12活跃的肿瘤边缘区域，从而限制了其深入肿瘤内部发挥杀伤作用。这一发现说明，细胞在组织中的空间定位，并不仅仅由外部微环境信号决定，也受到细胞内部转录调控程序的共同影响。环境因子与细胞内在因子之间的相互作用，共同塑造了免疫细胞在肿瘤中的空间行为与功能状态。
总体而言，SPAC-seq与TARDIS的建立，标志着空间功能基因组学（spatial functional genomics）进入了新的发展阶段。SPAC-seq首次将高通量CRISPR screen与单细胞分辨率空间转录组技术真正结合，使研究人员不仅能够分析基因扰动后的分子变化，还能够进一步解析这些变化在组织中的空间位置及其与微环境的关系。
这一平台具有较强的通用性与扩展性。SPAC-seq采用模块化设计，可兼容多种主流空间转录组平台，并且通过Direct-capture策略，未来还能够进一步扩展到CRISPRa/i、ORF筛选等多种空间扰动筛选体系。
与此同时，TARDIS作为首个基于统计学框架构建的空间扰动组学分析工具包，为不同类型的空间CRISPR筛选数据提供了标准化分析流程，显著降低了高维空间扰动数据的分析难度。研究团队认为，这套技术体系有望推动空间免疫学、肿瘤生物学、发育生物学以及药物靶点发现等多个领域的发展，为理解“基因如何在特定空间环境中发挥功能”提供全新的研究范式。
本文的通讯作者是北京大学曾泽贤，清华大学潘登，以及华大基因冯驭。北京大学前沿交叉科学研究院PTN项目的2022级博士生张皓睿、北京大学定量生物学中心（CQB）的2022级博士生张宗旭，以及北京大学生命科学联合中心（CLS）的2024级博士生王沛宇是本文的共同第一作者。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2026.04.049
SPAC-Seq数据下载链接：https://spac.pku-genomics.org