自噬是一种关键的细胞内降解过程，溶酶体通过该过程清除受损的细胞组分或潜在有害物质。这一受到严密调控的机制对于多种细胞功能至关重要，包括适应营养缺乏、免疫应答、细胞器修复以及程序性细胞死亡。

自噬失调已被证实与多种疾病相关，包括癌症、神经退行性疾病、感染以及代谢综合征，使其成为一个重要的治疗靶点。然而，自噬是一个高度动态且多步骤的过程，这对开发能够可靠测量活体系统中自噬通量的检测方法构成了挑战，而这一检测步骤对于理解自噬在生理和病理环境因素中的作用至关重要。

目前，追踪活细胞中自噬通量最广泛使用的方法是荧光蛋白（FP）标记的MAP1LC3/LC3（微管相关蛋白1轻链3）系统，其中mRFP-GFP-LC3构建体最为常用。该检测方法依赖于GFP和mRFP在溶酶体酸性环境因素中信号稳定性的差异，从而能够区分自噬体（由GFP和mRFP标记）和自噬溶酶体（仅由mRFP标记）。虽然该方法有效，但它具有依赖基因转染的显著局限性，这在原代细胞中通常效率低下或难以实现。

此外，过表达mRFP-GFP-LC3会增加背景信号，降低成像对比度。基因修饰也限制了其在体内的应用，因为在野生型小鼠中进行转染受到高度限制。这些挑战凸显了开发非基因编码探针以在原代细胞和活体系统中可靠追踪自噬通量的必要性。

图1.自噬成像的概念框架和研究设计（摘自Autophagy）

小分子荧光探针因其不依赖转染以及发射特性可调，提供了一种有前景的替代方案。目前已开发出多种利用自噬囊泡微环境因素（如pH值、粘度、极性等）的探针。然而，这些探针通常缺乏理想的特异性，因为这些微环境因素并非自噬囊泡所独有，这导致其准确性受到了影响，并凸显出对高特异性探针的未满足需求，以准确区分自噬囊泡并提供对自噬动力学的精确认识。

鉴于脂化LC3（LC3-II）是公认的自噬体蛋白标志物，直接靶向LC3进行探针开发为提高特异性提供了一条有前景的途径。通过利用LC3-自噬受体相互作用，已有几种探针通过将自噬受体SQSTM1/p62中关键的LC3相互作用区域（LIR）序列WTHL标记上荧光团而开发出来。

然而，由于这些偶联物的细胞通透性差，需要基于多聚精氨酸或多聚赖氨酸的细胞穿透基序。此外，这些探针在其游离形式、自噬体结合形式和自噬溶酶体结合形式之间无法提供动态信号，这损害了它们准确测量自噬通量的能力。一种理想的、具有出色细胞通透性且在这三种状态下能发出独特荧光信号的探针仍有待探索。

在本研究中，作者通过开发基于活性的探针ATP1应对了这一挑战。该探针具有小分子尺寸、良好的细胞膜渗透性以及三种状态下具有独特信号特征的优势。其自噬特异性通过与LC3结合得以实现，而其对自噬流（autophagic flux）的动态信号响应则通过微环境敏感型发射来实现。

ATP1采用迭代设计方法开发，利用分子对接研究以确保结合亲和力，并结合深入的结构-荧光特性分析以获得理想的动态信号。作者证明，ATP1探针在游离状态下无荧光，而在自噬体与自噬溶酶体之间能够呈现比例型信号变化，从而以低背景实现活细胞中自噬流的实时追踪，并通过不同的荧光信号轻松监测不同自噬阶段之间的转换。

值得注意的是，ATP1能够有效追踪原代神经元细胞和野生型小鼠中的自噬流，克服了遗传操作方法的局限性。作者的研究结果表明，ATP1作为一种稳健且多功能的工具，适用于监测自噬流，并在多种细胞系统和体内系统中具有广泛的应用前景。

参考消息：https://doi.org/10.1080/15548627.2026.2674717