RAG 核酸内切酶（RAG endonuclease）通过切割重组信号序列（recombination signal sequences，RSSs）启动 V(D)J 重组，随后这些断裂通过经典非同源末端连接（classical nonhomologous end-joining，c-NHEJ）途径完成修复。然而，53BP1 作为促进 c-NHEJ 的关键 DNA 损伤应答（DNA damage response，DDR）因子，对于 V(D)J 重组却并非必需。

2026年5月22日，北京大学张学飞独立通讯在Science Advances 在线发表题为“53BP1 orchestrates sequence feature of RAG targets to balance DNA repair outcomes during V(D)J recombination”的研究论文。该研究发现 53BP1 通过协调 RAG 靶位点的序列强度（sequence strength），塑造 V(D)J 重组过程中末端连接的特征。与其他 DDR 因子不同，53BP1 的缺失会特异性增加隐匿重组信号序列（cryptic RSS，cRSS）重组连接处的微同源性（microhomology，MH），而对经典 RSS 重组则无明显影响。该表型在 RIF1 或 Shieldin 缺失条件下能够部分重现，提示其涉及 53BP1 介导的末端连接调控轴。

值得注意的是，在经典切除修复因子和替代性末端连接因子中，仅 RNF168 的缺失能够完全逆转由 53BP1 缺失引起的 cRSS 重组连接微同源性增加现象，而其他相关因子的缺失则不能产生类似作用。此外，通过 RAG 突变体分析以及 RSS 评分分析，作者发现 RAG 靶位点的序列强度决定了 53BP1 在平衡末端连接结局中的独特作用。本研究为理解 V(D)J 重组过程中 RAG 切割的靶位点及脱靶位点（on-target 和 off-target）DNA 损伤修复机制提供了更深入的分子机制解释。

V(D)J 重组是适应性免疫的基础机制，其通过在淋巴细胞发育过程中以不同组合方式组装 V（可变区，variable）、D（多样性区，diversity）和 J（连接区，joining）基因片段，从而产生多样化的抗原受体初始库，以应对多种病原体。重组激活基因（recombination-activating gene，RAG）核酸内切酶是由两个 RAG1 亚基和两个 RAG2 亚基组成的 Y 型异源四聚体，其通过结合并切割位于 V、D 和 J 基因片段两侧的一对重组信号序列（recombination signal sequences，RSSs）来启动 V(D)J 重组。典型 RSS（bona fide RSS）由一个保守的回文七聚体序列（如 CACAGTG）和一个保守性较低、富含 A 的九聚体序列组成，两者之间由严格间隔的 12 bp 或 23 bp 序列分隔，分别称为 12RSS 和 23RSS。结构分析表明，高效的 RAG 结合和切割需要一个 12RSS 和一个 23RSS 的联会配对（synaptic pairing），即所谓的“12/23 RSS 法则”，该机制确保 RAG 能够准确识别生理性 V(D)J 重组所需的正确底物配对。

小鼠免疫球蛋白重链（immunoglobulin heavy chain，Igh）基因座包含超过 100 个下游带有 23RSS 的 VH 基因片段、超过 10 个两端均带有 12RSS 的 D 基因片段，以及 4 个上游带有 23RSS 的 JH 基因片段。“12/23 RSS 法则”指导 V(D)J 重组按顺序进行：首先发生 JH-23RSS 与下游 D-12RSS 的重组，随后上游 D-12RSS 再与 VH-23RSS 连接。这一顺序性重组受基因间调控区域1（intergenic control region 1，IGCR1）调控，该区域包含两个方向相反的 CTCF 结合元件（CTCF-binding elements，CBEs）。

图1.53BP1调控的RAG靶点序列强度模型及其对RAG启动的靶内与脱靶末端连接结局的调控（摘自Science Advances ）

染色质环挤压（chromatin loop extrusion）被认为是 RAG 扫描介导 V(D)J 重组的机制基础。RAG 被招募至 V(D)J 重组中心（recombination center，RC），对 Igh 基因座进行扫描并捕获 12RSS/23RSS 配对形成的联会复合体，从而促进 D-to-JH 和 VH-to-DJH 重组。除对典型 RSS 的稳定结合与高效切割外，染色质环挤压还促进 RAG 扫描并捕获和切割隐匿重组信号序列（cryptic RSS，cRSS），从而导致淋巴系统恶性肿瘤中的基因缺失及致癌性染色体易位。

RAG 启动的编码末端（coding ends）和 RSS 末端断裂在切割后复合体（postcleavage complex，PCC）中保持连接，随后通过经典非同源末端连接（classical nonhomologous end-joining，c-NHEJ）完成修复，分别形成编码连接（coding joins）和信号连接（signal joins）。Ku70/80、XRCC4 和 DNA 连接酶 IV（DNA ligase IV，LIG4）等核心 c-NHEJ 因子的缺失会严重损害 V(D)J 重组并阻断淋巴细胞发育，表明这些因子对于 V(D)J 重组至关重要。与核心 c-NHEJ 因子缺失引起的严重表型不同，DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）、Artemis、XLF、PAXX、MRI 和 ERCC6L2 等调节型 c-NHEJ 因子在处理和连接 RAG 诱导的编码末端及 RSS 末端过程中发挥特异性或冗余性作用。

另一方面，RAG 与核心 c-NHEJ 因子的相互作用可能促进 V(D)J 重组断裂的专属性 c-NHEJ 修复。此外，在 LIG4 缺失的前 B 细胞中，Ku70 可抑制 RAG 诱导 DNA 断裂的替代性末端连接（alternative end-joining，A-EJ），表明 c-NHEJ 机制在 V(D)J 重组过程中能够阻止替代修复途径的激活。

众所周知，DNA 损伤应答（DNA damage response，DDR）因子在一般 DNA 损伤修复及类别转换重组（class switch recombination，CSR）中的作用比在 V(D)J 重组中更为关键。作为关键 DDR 因子的共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ataxia telangiectasia mutated，ATM）可与 XLF 和 DNA-PKcs 等调节型 c-NHEJ 因子协同发挥冗余作用，在 V(D)J 重组中稳定并连接 RAG 切割产生的断裂。

在本研究中，作者构建了一系列缺失不同 DNA 损伤修复因子的 v-Abl 转化前 B 细胞系，并利用高通量测序技术证明，53BP1 在 RAG 启动的 RSS 与 cRSS 重组过程中发挥不同作用。在靶向位点（如典型 RSS）上，重组主要通过 c-NHEJ 完成，对 53BP1 的依赖性较低；而在脱靶位点（如 cRSS）上，53BP1 则决定修复结局：存在 53BP1 时促进 c-NHEJ，而缺失 53BP1 时，修复则转向依赖更长微同源序列（microhomology，MH）的替代修复方式。因此，从 RAG 介导脱靶重组的角度来看，该研究揭示了 53BP1 虽然遵循共同的作用原则，但会以依赖具体情境的方式发挥功能，并在 V(D)J 重组中产生不同于 CSR 或一般 DNA 损伤修复的功能结局。

参考消息：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aec2231