在高度保守且旁系同源基因丰富的基因家族中解读错义变异，仍然是理解蛋白质功能和推进精准医学的主要障碍。

2026年5月29日，清华大学欧光朔独立通讯在PNAS 在线发表题为“Comprehensive mutagenesis defines the functional landscape of human α-tubulin”的研究论文。该研究整合了全基因组诱变、高内涵活细胞成像以及自动化定量分析，构建了人类α-微管蛋白TUBA1A全部2683个单核苷酸编码变体的完整功能图谱。对微管组装的系统性分析揭示了不同类型的突变，这些突变会破坏折叠、分子伴侣结合以及原丝几何结构，从而界定了调控微管蛋白功能的结构约束条件。

该方法补充了基于保守性的预测工具，并实现了对疾病相关变异的功能性重新解读。分子动力学模拟进一步揭示了GTP（三磷酸鸟苷）结合、二聚体接触以及侧向界面中的局部扰动如何传递并改变丝状体结构。整合这些数据集后，作者建立了一个可跨微管蛋白亚型和物种推广的预测框架，从而能够准确推断变异效应。这项工作确立了一种可扩展、高分辨率的策略，用于保守蛋白质的功能注释，并为细胞骨架组装及其灵活性提供了机制性见解。

在高度保守且存在大量旁系同源物的基因家族中解读错义变异，仍是理解蛋白质功能以及建立变异效应预测框架的关键挑战。高通量测序技术的进步已揭示数百万个编码变异，然而超过90%的变异在功能上仍未被表征，这限制了对机制的洞察和可解释性。传统的遗传学方法，包括基于家系的连锁研究和病例-对照关联分析，缺乏评估罕见变异（尤其是在呈现旁系同源冗余的蛋白质中）细微功能效应的分辨率。

深度突变扫描（DMS）和变异效应多重分析（MAVE）提供了无偏、高通量的策略，用以系统评估数千个编码变异的影响，从而能够构建疾病相关基因的功能图谱，并为美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）及分子病理学协会（AMP）制定的变异解读指南提供信息。然而，传统的DMS方法通常依赖于通过诸如基于rtITP的诱变、饱和基因组编辑、饱和先导编辑和CREATE等方法生成的混合变异文库。这些方法常将混合文库与简单的表型读数相结合，包括基于生长的筛选或流式细胞术检测，但这些方法缺乏检测细微或空间受限的细胞缺陷（例如异常的细胞器形态或局部组装中断）所需的分辨率。在具有高度序列同源性的基因家族中，这些局限性变得更加突出，因为功能冗余可能掩盖单个错义变异的影响。作为替代方案，大规模并行诱变方法将每个变异作为单个变体生成，从而实现更精确的功能评估。这可通过SOEing、PALS、一锅法诱变、PFunkel、SUNi、大规模并行合并和SMuRF等方法实现。然而，其中许多技术需要大量的酶消化、纯化步骤或迭代组装，这使得它们劳动强度大，且不适合用于对数千个变异进行流线化、高通量的生成。

图1.AS图谱强调了微管蛋白同型之间的差异限制，并修订了tuba1a的临床分类（摘自PNAS ）

微管蛋白家族是这些挑战的典型例证。微管蛋白是进化上保守的细胞骨架蛋白，对于包括细胞分裂和细胞内运输在内的许多基本过程至关重要。α-和β-微管蛋白基因的致病性突变会导致人类疾病，统称为“微管蛋白病”。尽管具有广泛的临床关注，但大多数α-和β-微管蛋白的错义变异仍未得到分类。高度相似的α-微管蛋白同型之间的功能冗余对变异解读构成了主要障碍，因为补偿性表达常常掩盖单个错义变化的影响。人类基因组编码九种α-微管蛋白同型，它们共享超过90%的序列同一性，从而形成广泛的旁系同源同源性，这掩盖了同型特异性的功能缺陷，并限制了DMS方法的解析能力。这种高度的保守性进一步混淆了计算预测工具：像AlphaMissense这样严重依赖进化保守性的工具，几乎对所有α-微管蛋白错义变异都赋予了高的有害性评分，导致在富含旁系同源物的基因家族中系统性地过度预测致病效应。这些挑战凸显了对能够解析高度保守蛋白质中错义变异所产生的细微、上下文依赖性后果的实验框架的需求。

为克服这些局限性，作者针对人类α-微管蛋白基因TUBA1A开发了一套整合性的实验-计算流程，结合了饱和诱变、高内涵成像和基于人工智能的分析。该平台能够系统性地绘制所有2,683个编码单核苷酸变异（SNV）的图谱，揭示了对微管（MT）组装至关重要的残基水平约束。通过整合结构建模和机器学习预测，作者生成一个可预测、可推广的变异解读框架，为微管蛋白功能提供了机制性见解，并建立了一种可扩展的方法用于功能性地注释保守蛋白质。

参考消息：https://doi.org/10.1073/pnas.2600822123