蛋白质是生命的基础构建单元，因为细胞过程在很大程度上由组织良好的蛋白质组装体所调控。这些蛋白质机器涵盖从静态到动态组装的蛋白质复合物，且常受翻译后修饰的调节。此类复合物的典型范例是由磷酸酪氨酸（pTyr）介导的复合物，它们在数分钟甚至数秒内受到时空调控，并由携带pTyr结合结构域的支架蛋白精密组织。

反映不同刺激（如分泌配体和细胞-细胞交互作用）的pTyr蛋白复合物动态变化已整合到多种信号网络中，尤其是在免疫微环境中。更重要的是，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的激酶抑制剂及免疫检查点疗法数量持续增加，凸显了pTyr介导的信号转导在靶向治疗中的重要性。然而，在其天然生物系统中高效捕获这些动态信号事件仍是一项重大技术挑战。

邻位标记（PL）结合基于质谱（MS）的蛋白质组学技术，能够在活细胞中精确捕获和鉴定与靶蛋白密切相关的蛋白质。在这些方法中，BioID已被广泛用于研究活细胞中的亚细胞蛋白质组及稳定蛋白复合物。然而，BioID需要长时间标记，这限制了其在分析动态蛋白质组装体中的应用。

尽管BioID的TurboID变体显示出更高的标记效率，并将标记时间缩短至10分钟，但仍不适用于研究快速的蛋白质动态。近期光反应酶（PRE）介导标记技术的进展，包括SOPP3−APEX2、miniSOG、LOV-Turbo及LITag，利用可见光激活在秒级时间内控制PL过程。然而，这些方法仍面临局限性，例如对活体动物的光穿透能力有限。

APEX2由豌豆抗坏血酸过氧化物酶APX演化而来，是一种适用于时空蛋白质复合物分析（如数秒内动态组装的G蛋白偶联受体（GPCR）相关复合物）的常用PL酶。为提升APEX2的标记选择性，作者鉴定出底物探针BP5和BN2，它们通过聚合作用具有自淬灭特性，在标记动态蛋白质复合物（尤其是那些缺乏明确细胞定位的复合物）方面优于生物素-酚。

然而，APEX2对H₂O₂的依赖性限制了其在研究活体系统及H₂O₂敏感信号通路中动态过程的应用。这些挑战凸显了对具有更优动力学、选择性和生物相容性的新型PL技术的需求，以推动体内动态蛋白质组装体的研究。

图1.全文总结图（摘自Nature Chemical Biology）

为应对上述挑战，作者开发了ROProx系统，该系统整合了无外源性H₂O₂的光反应标记，同时保留了APEX2介导PL的快速动力学特性。作者通过化学演化16种合理设计并合成的候选探针，鉴定出BN2是一种高效且高选择性的探针，能够以APEX2依赖的双模态方式标记动态蛋白质复合物。

BN2在PL方法学上代表了两个关键方面的重大进展。在第一模态中，由于其与APEX2的高结合亲和力以及对APEX2酪氨酰自由基的亲和性，BN2能在数秒内对活细胞中10纳米半径范围内的蛋白质复合物进行高度选择性的光反应标记。

值得注意的是，该标记反应优先靶向组氨酸残基而非酪氨酸，并受大气O₂和温和蓝光照射的精确调控。此外，这种BN2–APEX2依赖的PL方法完全无需H₂O₂，因此特别适用于H₂O₂敏感的生物系统。至关重要的是，通过一种独特的双刹车机制实现了高标记选择性，该机制涉及BN2对APEX2 His42残基的位点特异性标记以及通过BN2聚合实现的自淬灭。

在第二模态中，ROProx对极低水平的H₂O₂有反应，并倾向于标记酪氨酸残基，这非常适合体内应用，正如作者在活体动物模型中展示的动态相互作用组分析那样。总的来说，ROProx所提供的精细调谐的标记性能在多种活细胞和体内系统中的应用具有广泛潜力。

参考消息：https://www.nature.com/articles/s41589-026-02230-0