监测单个活细胞内的分子活动对于理解细胞分化、衰老、异质性和疾病进展至关重要。然而，传统的单细胞分析通常依赖于显微操作或提取后进行下游测量，这无法捕捉原位的实时动态变化。荧光标记和电化学方法提供了时间分辨率，但在标记、底物范围和多重检测能力方面存在局限性。
2026年4月15日，中国科学院化学研究所吴海臣和西华大学刘蕾共同通讯在PNAS在线发表题为In situ and real-time monitoring of intracellular activities in single live cells using a nanopore probe的研究论文。该研究展示了一种纳米孔探针，能够对单个活细胞内的活动进行实时的多重监测。
该装置集成了用于分子提取的氧化铝纳米管膜和用于单通道电学检测的玻璃纳米孔膜。利用缺血-缺氧的海马神经元模型，作者同时追踪了细胞内谷氨酸、抗坏血酸和三磷酸腺苷——这三种参与氧糖剥夺诱导的神经元水肿的关键分子的动态变化。
该研究结果确立了这种纳米孔探针作为一个强大的平台，能够在单细胞水平进行实时的、无标记的分子分析，为研究疾病机制和治疗反应开辟了新的机会。
细胞是生命的基本单位，细胞内生物分子的动态变化直接调控基因表达、代谢活动和信号转导等关键生物学过程。持续监测细胞在其天然状态下的活动，对于追踪分化与衰老等基本过程、理解细胞异质性、疾病进展以及复杂微环境内的相互作用至关重要。
传统的单细胞分析通常涉及使用微流控或光镊进行显微操作或细胞分选，随后进行细胞裂解。然后通过质谱、荧光、电化学、酶联免疫吸附测定、PCR和其他技术对提取的样本进行分析。虽然这些方法提供了对细胞组分的定量见解，但它们无法捕捉原位的实时动态变化。
最近的进展，包括使用纳米管和流体力学显微镜进行单细胞提取，使得在保持细胞活力的同时能够分析亚细胞内容物或细胞器。然而，这些方法仍然依赖于离线定量，仅提供离散的时间快照，缺乏实时监测能力。
荧光标记和电化学技术可以提供细胞活动的时间分布，但受限于标记需求、底物兼容性受限以及多重检测能力有限。因此，迫切需要能够对活体单细胞内动态分子变化进行连续、实时监测的技术。
纳米孔传感是一种无标记的单分子检测技术，能够识别单个生物分子。当分析物与纳米孔相互作用时，会扰动离子电流，产生可测量的波动。通过分析电流幅值变化和平均滞留时间，可以确定分析物的身份。此外，事件频率与分析物浓度相关，提供定量信息。
迄今为止，纳米孔已广泛应用于随机传感、单分子化学、DNA测序和蛋白质测序。纳米孔传感器具有几个独特的优势，如单分子分辨率、无标记检测、实时分析、定量输出、高通量，所有这些对于单细胞分析都非常理想。然而，由于技术挑战，特别是脂质双层的脆弱性和将纳米孔插入活细胞的困难，它们在单细胞研究中的应用仍然有限。
用于单细胞原位分子提取与检测的纳米孔探针示意图（图片源自PNAS）
在这项工作中，作者开发了一种纳米孔探针，能够实时同步监测单个活细胞内的多种生物分子和细胞内活动。该探针由一个外部毛细管（配备用于细胞内提取的纳米管膜）和一个内部毛细管（包含用于单通道记录的玻璃纳米孔膜）组成。
纳米管膜通过原子层沉积（ALD）在径迹蚀刻聚碳酸酯（TEPC）膜上涂覆氧化铝，随后进行反应离子刻蚀（RIE）制备而成。这些微米长的纳米管 gently 穿透细胞膜，实现对细胞内内容物的微创取样。玻璃纳米孔膜通过在玻璃毛细管内密封一根纳米锥形铂丝，然后进行机械抛光和化学蚀刻制备而成。
在膜上形成脂质双层，并将化学修饰的耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）突变体插入其中。这种工程化的MspA能够通过独特的离子电流特征选择性识别谷氨酸（Glu）、抗坏血酸（AA）和三磷酸腺苷（ATP）。作者将这种纳米孔探针应用于由氧糖剥夺（OGD）诱导的缺血-缺氧海马神经元模型，以探索神经元水肿过程中细胞内小分子的实时动态变化。
结果表明，作者的系统能够在单细胞水平实现实时的原位分子监测，揭示了传统技术无法获取的丰富动态信息。该平台为研究细胞微环境内的分子相互作用提供了强大工具，并为研究疾病进展和开发治疗策略开辟了新途径。
原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2529161123