基于Cas13的RNA效应因子可在细菌中实现动态、多重且可逆的基因调控。然而，其广泛应用受到固有的细胞毒性和附带切割效应的限制。
2026年6月2日,上海交通大学童垚俊独立通讯在Nature Biotechnology在线发表题为Programmable, multiplexed and orthogonal gene control in bacteria with attenuated Cas13d systems的研究论文。
该研究提出了一种理性的蛋白质工程策略，通过靶向截断柔性区域，生成具有可调RNase活性的减毒Cas13d变体。这使得在有效实现转录本敲低的同时，毒性显著降低，表现为生长光密度提高2.2倍。通过将CRISPR RNA间隔区5′端引入近端错配，作者的系统实现了翻译抑制、多顺反子mRNA降解以及基于IF3融合的翻译水平CRISPR激活之间的功能切换。
作者证明了在多顺反子mRNA及合成回路中，对单个基因进行可编程、正交且多重调控的能力。将该系统应用于番茄红素生物合成优化中，展示了在大肠杆菌中对必需代谢途径和竞争性代谢途径进行精细调控后，代谢途径的有效重构及产量的提升。
本研究为下一代微生物合成生物学及基于RNA的生物技术提供了一种通用的RNA调控工具包。
在RNA层面实现对基因表达的可编程与精准控制，正成为合成生物学的前沿关键领域。相较于传统靶向DNA的方法，这类基于RNA的策略具有响应迅速、正交性强及可调性高的显著优势，尤其对下一代微生物合成生物学具有高度吸引力。
靶向RNA的CRISPR系统，尤其是第2类VI型CRISPR–Cas13效应器，能以高度序列特异性切割单链RNA，从而实现对转录后过程的精确调控，并为基因网络与代谢通路的精细调节开辟了新途径。在真核生物中，基于Cas13或催化失活型Cas13（dCas13）的系统已能够实现高效的、可编程的RNA敲低、编辑以及用于成像的转录本标记。
然而，Cas13技术在细菌中的全部潜力尚未得到发挥，这主要是由于其固有的附带切割活性导致的细胞毒性、不可预测的宿主反应以及有限的可编程性所致。以往通过点突变或结构域工程来降低Cas13相关毒性的努力虽然提高了保真度，但这些变体很少在原核系统中得到验证。因此，目前仍缺乏一种广泛适用的策略，能够将Cas13d转变为一种用于细菌的精准、稳健且真正可编程的RNA工具。
多数原核基因以操纵子形式编码。基于蛋白的DNA靶向工具，尤其是基于dCas9或dCas12的CRISPR干扰与激活技术，已彻底改变了细菌和真核生物中的基因控制方式。然而，由于靶向操纵子内部基因时会产生极性效应，这些工具通常仅限于在操纵子层面进行调控。
相比之下，dCas13已展现出在多顺反子转录本内对单个基因进行翻译水平CRISPR干扰的潜力。然而，其无法介导转录本降解或激活，这限制了其调控范围。近期结合dCas9与dCas13实现多层控制的策略，虽能在操纵子和单基因层面同时进行调控，但代价是增加了系统复杂性和代谢负担。这些局限性凸显了开发一种更简单、更具可扩展性的基于RNA的工具包的必要性。
图1.atnCas13d-IF3在大肠杆菌合成番茄红素的正交优化中的应用（摘自Nature Biotechnology）
在此，作者通过开发合成正交核酸激活与抑制系统（SONAR）来应对这些挑战，该系统是一种基于Cas13d的多功能基因调控工具，适用于大肠杆菌。作者证明，只有具备适当活性水平的Cas13d才能实现高选择性的切割。
通过针对柔性区域进行靶向截断的系统性蛋白工程，作者生成了具有可调RNase活性且细胞毒性降低的减毒Cas13d（atnCas13d）变体。作者进一步发现，CRISPR RNA（crRNA）间隔区中5′近端的错配能够独立调控RNase活性和RNA结合活性，从而使单个效应器能够在需要时在翻译抑制与多顺反子mRNA降解之间进行切换。
通过将atnCas13d与细菌翻译起始因子IF3融合，作者实现了一种强大的、能够进行模块化基因激活的tlCRISPRa系统。作为概念验证，作者将此工具箱应用于优化大肠杆菌中的番茄红素产量，展示了多重代谢重塑，包括有效下调经典的基于DNA编辑的工程改造先前无法触及的必需竞争性代谢通路。
本研究建立了一种由crRNA编程的多功能Cas效应器，其中不同的调控结果完全由crRNA设计决定，从而实现从多顺反子mRNA调控到单基因微调的灵活控制。
参考消息：https://www.nature.com/articles/s41587-026-03160-x